注意事項：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。
產(chǎn)品名稱 | 轉(zhuǎn)基因植物PAT基因核酸試劑盒規(guī)格 |
規(guī)格 | 48T |
貨號 | LZP8172 |
組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。
實驗過程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer 5μl
dNTP mixl 4μl
引物1（10pM） 2μl
引物2（10PM） 2μl
Taq酶（2U/μl） 1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl
加ddH2O至 50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個的PCR實驗室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實驗與實驗之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。
小鼠骨成型蛋白受體1A(mouse BMP-R1A)ELISA48T/96T進(jìn)口分裝
小鼠骨成型蛋白受體Ⅱ(mouse BMP-R2)ELISA48T/96T進(jìn)口分裝
小鼠腦鈉肽(mouse BNP)ELISA48T/96T進(jìn)口分裝
小鼠N端前腦鈉素(mouse NT-proBNP)ELISA48T/96T進(jìn)口分裝
小鼠骨唾液酸蛋白(mouse BSP)ELISA48T/96T進(jìn)口分裝
小鼠CXCL3(mouse CXCL-3)ELISA48T/96T進(jìn)口分裝
小鼠CXCR4(mouse CXCR-4)ELISA48T/96T進(jìn)口分裝
小鼠皮質(zhì)酮(mouse Corticosterone)ELISA48T/96T進(jìn)口分裝
小鼠環(huán)氧化酶-2 (mouse COX-2)ELISA48T/96T進(jìn)口分裝
小鼠結(jié)締組織生長因子(mouse CTGF)ELISA48T/96T進(jìn)口分裝
小鼠細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4 (mouse CTLA-4)ELISA48T/96T進(jìn)口分裝
7－氨基去酰氧基頭孢烷酸（7-ADCA）（標(biāo)準(zhǔn)品）(R)-哌啶甲酸酯-L-鹽
β淀粉樣肽1-42(C端)/β-Amyloid 1-42 (CT)Fibulin 1/FITC 熒光素標(biāo)記抗“衰老關(guān)鍵蛋白”IgG100 ul
β淀粉樣肽1-28/β-Amyloid 1-28Fibulin-5/FITC 熒光素標(biāo)記抗“衰老關(guān)鍵蛋白”IgG100 ul
激活素受體2AFLG/FITC 熒光素標(biāo)記絲聚蛋白/中間絲蛋白IgG20 ul
水通道蛋白5FLIP S/L /FITC 熒光素標(biāo)記凋亡調(diào)節(jié)基因之一IgG100 ul
β淀粉樣肽（1-40）FLIPS/FITC 熒光素標(biāo)記凋亡調(diào)節(jié)基因之一（短型）IgG100 ul
β淀粉樣肽（1-42）FN /FITC 熒光素標(biāo)記纖維連結(jié)蛋白IgG100 ul
載脂蛋白A1FN/RBITC 紅色熒光素標(biāo)記纖維連接蛋白IgG100 ul
β-抑制蛋白1FOS B/FITC 熒光素標(biāo)記FosBIgG100 ul
轉(zhuǎn)基因植物PAT基因核酸試劑盒規(guī)格人活化素A(ACV-A)ELISA試劑盒英文名稱：Human Activin A，ACV-A ELISA Kit*
人肌鈣蛋白Ⅰ(Tn-Ⅰ)ELISA試劑盒英文名稱：Human Troponin Ⅰ，Tn-Ⅰ ELISA Kit*
人肌鈣蛋白T(Tn-T)ELISA試劑盒 英文名稱：Human Troponin T，Tn-T ELISA Kit進(jìn)口/原裝
人肌紅蛋白(MYO/MB)ELISA試劑盒英文名稱：Human Myoglobin，MYO/MB ELISA Kit進(jìn)口/分裝
人肌腱蛋白R(TN-R)ELISA試劑盒英文名稱：Human tenascin-R,TN-R ELISA Kit*
人肌球蛋白(MYS)ELISA試劑盒英文名稱：Human Myosin，MYS ELISA Kit進(jìn)口/原裝小鼠分泌型免疫球蛋白A(sIgA)ELISA試劑盒 組裝/原裝
小鼠肺炎病毒（PVM）ELISA試劑盒 組裝/原裝
小鼠肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白A(SP-A)ELISA試劑盒 組裝/原裝
小鼠泛素蛋白(Ub)ELISA試劑盒 組裝/原裝
檢測步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照)，每個測試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個反應(yīng)加入的量 N個反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時收集熒光信號。報告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。
48T/96T
