50112檢測高效相色譜儀
1 簡介
本文參照GB/T 17819-1999標(biāo)準(zhǔn)采用了501系列高效液相色譜法測定維生素預(yù)混料中12的方法。501高效液相色譜儀適用于維生素預(yù)混料、12預(yù)混制劑中12的測定。檢測范圍為每千克樣品中12含量大于0.25mg,
2 方法原理
試樣中12用水提取，經(jīng)高效液相色譜反相柱分離，其峰面積與12的含量成正比
3 試劑和材料
本標(biāo)準(zhǔn)所用試劑除特殊注明外，均為優(yōu)級純，水為去離子水。
3.1 乙睛:色譜純。
3.2 正磷酸溶液
3.3 25%乙醇溶液
3.4 12標(biāo)準(zhǔn)溶液。
3.4.1 12標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液:準(zhǔn)確稱取0.1000g12純品(符合USP),溶解于100Ml乙醇溶液(3.3)中，并稀釋定容至刻度，搖勻。該標(biāo)準(zhǔn)貯備液每毫升含12 1mg.
3.4.2 12標(biāo)準(zhǔn)工作液:準(zhǔn)確吸取12標(biāo)準(zhǔn)貯備液(3.4.1)1mL于50Ml容量瓶中，用移動相稀釋定容刻度，搖勻。該標(biāo)準(zhǔn)工作液1Ml含12 2ug
4 儀器、設(shè)備
4.1 實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備。
4.2 超聲波水浴。
4.3 高效液相色譜儀:進(jìn)口手動進(jìn)樣器（自動進(jìn)樣器）,501高效液相色譜儀、紫外可調(diào)波長檢驗(yàn)器
4.4 超純水裝置
4.5 離心機(jī):3000r/min.
5 試樣制備
取具有代表性樣品至少500g，用四分法縮分至100g， 粉碎，全部過0.28mm 孔篩混勻，裝入樣品瓶內(nèi)密閉，避光低溫保存?zhèn)溆谩?/span>
6 分析步驟
6.1 提取
6.1.1 維生素預(yù)混料中12的提取
稱取試樣 2-3g (精確至士0.0001g )，置于100mL棕色容量瓶中，加約60mL去離子水，在超聲波水浴中超聲提取15min，取出，用去離子水定容至刻度，混勻，過濾，濾液過0.45um濾膜，供高效液相色譜儀分析。
6.1.2 12制劑(1%-2%)的提取
稱取試樣1g(精確至±0.0001g)于100mL棕色容量瓶中，加人約60mL去離子水，在超聲波水
浴中超聲提取10min，取出用去離子水定容過濾。精確吸取1.00mL溶液于50mL棕色容量瓶中，用去離子水定容至刻度，該液通過0.45um濾膜過濾，供高效液相色譜儀分析
6.2 測定步驟
6.2.1 色譜條件
柱子 :u-Bondpak NH2,粒度5um,3.9mm×300mm。Vertex NH2色譜柱，5um，4.6×250mm
柱溫 :30℃。
流動相 : 3%正磷酸水溶液260mL與700mL乙膀混合，超聲脫氣。
流速 : 1.7mL/min,
檢測波長 :361nm。
6.2.2 定量測定
按高效液相色譜儀說明書調(diào)整儀器操作參數(shù)，用兩次以上相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)工作液，對系統(tǒng)進(jìn)行校正。
將通過0.45um濾膜的樣液(6.1.1)依次分裝于自動進(jìn)樣小瓶中，依外標(biāo)法上液相色譜儀測定
6.2.3 也可采用反相離子對高效液相色譜測定12的方法(見附錄A)
7 測定結(jié)果的計(jì)算
測定結(jié)果按式(1)計(jì)算w1=Pi×V×pi×Vst/Pn×m×Vi
式中w1一每千克樣品中12的含量，mg;
m- 試樣質(zhì)量，g;
Vi-試樣溶液進(jìn)樣體積,uL;
Pi-試樣溶液峰面積值;
V-試樣稀釋的體積，mL;
Pi-標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，ug/mL;
Vst-標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣體積,uL;
Pn-標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積平均值。
每個試樣取兩份試料進(jìn)行平行測定，以其算術(shù)平均值為測定結(jié)果。結(jié)果表示到每千克樣品中12 O.01mg
8 允許差
同一分析者對同一試樣同時(shí)兩次平行測定結(jié)果的相對偏差應(yīng)不大于15%
反相離子對高效液相色譜測定預(yù)混料中維生案B12
A1 原理
試樣中12經(jīng)水提取后，注人反相色譜柱上，由于輸入了有機(jī)的反相離子對四丁基磷酸銨(PIC A)和己烷磺酸鈉(PIC-B6)溶掖，12的陽離子與移動相中陰離子形成離子偶化合物，在移動過程中與固定相分開達(dá)到分離.
A2 試劑和材料
1 甲醇(優(yōu)級純)。2 磷酸。
3 四丁基磷酸銨(PIC A),4 己烷磺酸鈉(PIC-B6),
A3 測定色譜條件
柱子 :150 m×4.0mm(內(nèi)徑)不銹鋼柱。VertexC18色譜柱，250mm×4.6，5um進(jìn)口
固定相 :u-Bondpak C18(ODS)粒度5um,
移動相 :甲醇-水(250+750)約980mL，加入PICA/PICB6(各一小瓶)20mL，用上述25%甲醇水定
容至1L,混勻，用磷酸調(diào)節(jié)pH3,流速 :1ml/min,
柱溫 :室溫 檢測器 :紫外檢測器，使用波長365nm,
進(jìn)樣量 : 20uL,保留時(shí)間 :約7.0min
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