規(guī)格：100管/48樣

亞硝酸還原酶（Nitrite reductase，NiR ）試劑盒說明書

微量法

注意：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義

硝酸還原酶（NiR）是一類能催化亞硝酸鹽還原的酶，廣泛存在于微生物及植物體內(nèi)，是自然界氮循環(huán)過程中的關(guān)鍵酶，可以將亞硝酸鹽降解為NO或NH3，從而減少環(huán)境中亞硝態(tài)氮的積累，降低因亞硝酸鹽累積而造成的對生物體的毒害作用。

測定原理

亞硝酸還原酶可將NO₂^-還原為NO，使樣品中參與重氮化反應(yīng)生成紫紅色化合物的NO₂^-減少，即 540nm處吸光值的變化可反應(yīng)土壤中亞硝酸還原酶的活性。

需自備的儀器和用品

天平、研缽、可見分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板、水浴鍋、低溫離心機。

試劑的組成和配制

試劑一：液體 112mL×1 瓶，4℃保存。

試劑二：液體 1.5mL×1 支，4℃保存。

試劑三：液體 1mL×1 支，4℃保存。

試劑四：粉劑×1 支，4℃避光保存。臨用前加0.6mL蒸餾水充分溶解。

試劑五：粉劑×1 瓶，4℃避光保存。臨用前加3.2mL蒸餾水充分溶解。

顯色劑 A：液體 2 mL×1 瓶，4℃避光保存。

顯色劑 B：液體 2mL×1 瓶，4℃避光保存。

臨用前，根據(jù)用量將顯色劑A和顯色劑B按1:1的比例混合。

酶液提取

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一），進行冰浴勻漿。10000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2．細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后10000g，4℃離心10min，取上清置于冰上待測。

測定操作表

注意：空白管只需測定一次。

計算公式

a. 使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.0136x-0.005，R²=0.9981

1．按照蛋白含量計算

酶活單位定義：每毫克組織蛋白每小時還原1μmol NO₂ˉ的量為一個酶活力單位。

NiR（μmol/h/mg prot）=[A空白管-(A測定管-A對照管)+0.005]÷0.0136×V反總÷（V樣×Cpr）÷T=490.2×（A 空白管-A 測定管+A 對照管+0.005）÷Cpr

2. 按照樣本質(zhì)量計算

酶活單位定義：每克組織每小時還原1μmol NO₂ˉ的量為一個酶活力單位。

NiR（μmol/h/g）=[A 空白管-(A 測定管-A 對照管)+0.005]÷0.0136×V 反總÷（W×V 樣÷V 樣總）÷T= 490.2×（A 空白管-A 測定管+A 對照管+0.005）÷W

3. 按照細(xì)胞數(shù)量計算

酶活單位定義：每10⁴個細(xì)胞每小時還原1μmol NO₂ˉ的量為一個酶活力單位。

NiR（μmol/h/10⁴cell）=[A 空白管-(A 測定管-A 對照管)+0.005]÷0.0136×V 反總÷（細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V 樣總）÷T=490.2×（A 空白管-A 測定管+A 對照管+0.005）÷ 細(xì)胞數(shù)量

V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.2mL；V 樣：體系中加入樣本體積，0.03mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時間，1h； Cpr：樣本蛋白含量；W：樣本質(zhì)量，g

b. 使用96孔板測定的計算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y =0.0068x-0.005，R²=0.9981

1．按照蛋白含量計算

酶活單位定義：每毫克組織蛋白每小時還原1μmol NO₂ˉ的量為一個酶活力單位。

NiR（μmol/h/mg prot）= [A 空白管-(A 測定管-A 對照管)+0.005]÷0.0068×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷T= 980.4×（A 空白管-A 測定管+A 對照管+0.005）÷Cpr

2. 按照樣本質(zhì)量計算

酶活單位定義：每克組織每小時還原1μmol NO₂ˉ的量為一個酶活力單位。

NiR（μmol/h/g）= [A 空白管-(A 測定管-A 對照管)+0.005]÷0.0068×V 反總÷（W×V 樣÷V 樣總）÷T= 980.4×（A 空白管-A 測定管+A 對照管+0.005）÷W

3. 按照細(xì)胞數(shù)量計算

酶活單位定義：每10⁴個細(xì)胞每小時還原1μmol NO₂ˉ的量為一個酶活力單位。

NiR（μmol/h/10⁴cell）= [A空白管-(A測定管-A對照管)+0.005]÷0.0068×V 反總÷（細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總）÷T= 980.4×（A空白管-A測定管+A 對照管+0.005）÷ 細(xì)胞數(shù)量

V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.2mL；V 樣：體系中加入樣本體積，0.03mL；V 樣總：加入提

取液體積，1mL；T：反應(yīng)時間，1h； Cpr：樣本蛋白含量；W：樣本質(zhì)量，g

注意事項

配制好的試劑三、試劑四3天內(nèi)使用完。