組織固定
新鮮組織應(yīng)及時(shí)固定，一般推薦使用10%中性福爾馬林固定6-24小時(shí)。如果固定不夠可能會(huì)造成蛋白彌散或降解，出現(xiàn)陰性染色或周邊陽性中心陰性染色；如果過固定可能會(huì)造成蛋白空間結(jié)構(gòu)交聯(lián)過度，即使經(jīng)過抗原熱修復(fù)也難以出現(xiàn)陽性結(jié)果，或出現(xiàn)中心有陽性周圍陰性的染色結(jié)果。可以將Vimentin作為檢驗(yàn)標(biāo)本的固定情況的指標(biāo)，因?yàn)閂imentin蛋白抗原決定簇對醛類比較敏感，且Vimentin廣泛分布于幾乎各種組織中，如血管內(nèi)皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞均陽性，所以可以參考Vimentin的染色結(jié)果來判斷組織固定情況。
烤片
推薦烤片條件為56℃-60℃ 1-2小時(shí)或過夜。溫度過高會(huì)破壞抗原決定簇，產(chǎn)生假陰性。
一抗
儲(chǔ)存條件是否合適，有些抗體（如Santa Cruz公司的抗體）不能冷凍保存；避免抗體反復(fù)凍融；使用濃度過低；孵育時(shí)間過短；試劑是否在有效期內(nèi)。隨著儲(chǔ)存時(shí)間延長，抗體的效價(jià)也會(huì)發(fā)生變化，應(yīng)及時(shí)調(diào)整。
檢測系統(tǒng)
所使用的檢測系統(tǒng)是否和一抗匹配，通用型檢測系統(tǒng)只能檢測小鼠和兔來源的抗體，不能用于山羊來源的一抗的檢測；如果檢測系統(tǒng)中包含兩種以上的試劑，注意使用順序是否正確；注意檢測系統(tǒng)的靈敏度，一般而言Polymer二步法檢測試劑靈敏度高于SP三步法檢測試劑，同等類型的檢測系統(tǒng)中辣根酶檢測系統(tǒng)的靈敏度是堿磷酶檢測系統(tǒng)的四倍，目前我公司所售的檢測系統(tǒng)中PV-9000是靈敏度zui高的產(chǎn)品，如果所檢測的抗原含量較低，必須考慮這些因素。
顯色系統(tǒng)
所使用的顯色劑是否是檢測系統(tǒng)中標(biāo)記酶的底物，一般辣根酶用DAB（棕黃色）和AEC（紅色）顯色，堿磷酶用BCIP/NBT（藍(lán)色）和AP-red（紅色）顯色，其中DAB的靈敏度zui高，是AEC的四倍。
封片
選擇合適的封片劑至關(guān)重要。目前市售的封片劑分為兩大類，一類是醇溶性的（如中性樹膠、香味封片劑），一類是水溶性的（如GVA）。如果底物所產(chǎn)生的終末產(chǎn)物溶于有機(jī)溶劑（如AEC、AP-red等），就不適用醇溶性封片劑封片，否則會(huì)褪色乃至出現(xiàn)陰性結(jié)果。
其他步驟
組織切片上殘留的PBS/TBS沖洗液過多，進(jìn)一步稀釋了抗體；蛋白含量過低或無表達(dá)，應(yīng)設(shè)立陽性對照片；復(fù)染過深導(dǎo)致遮蓋陽性信號(hào)，尤其是核陽性的抗體；某些抗原決定簇對H2O2敏感，如CD4，應(yīng)用低濃度的H2O2或省略。
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