豚鼠內(nèi)皮素1（ET-1）ELISA Kit

   豚鼠內(nèi)皮素 1（ET-1）酶聯(lián)免疫分析
試劑盒使用說明書
本試劑僅供研究使用         目的：本試劑盒用于測定豚鼠血清，血漿及相
關(guān)液體樣本中內(nèi)皮素 1（ET-1）的含量。
豚鼠內(nèi)皮素1（ET-1）ELISA Kit實驗原理：
本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中豚鼠內(nèi)皮素1（ET-1）水平。用純化的豚鼠內(nèi)皮素1（ET-1）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入內(nèi)皮素1（ET-1）再與HRP標記的ET-1抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在 HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的內(nèi)皮素 1（ET-1）呈正相關(guān)。用酶標儀在 450nm 波長下測定吸光度（OD 值），通過標準曲線計算樣品中豚鼠內(nèi)皮素1（ET-1）濃度。
試劑盒組成：
試劑盒組成 48 孔配置 96 孔配置 保存
說明書 1 份 1 份
封板膜 2 片（48） 2 片（96）
密封袋 1 個 1 個
酶標包被板 1×48 1×96 2-8℃保存
標準品：135ng/L 0.5ml×1 瓶 0.5ml×1 瓶 2-8℃保存
標準品稀釋液 1.5ml×1 瓶 1.5ml×1 瓶 2-8℃保存
酶標試劑 3 ml×1 瓶 6 ml×1 瓶 2-8℃保存
樣品稀釋液 3 ml×1 瓶 6 ml×1 瓶 2-8℃保存
顯色劑A 液 3 ml×1 瓶 6 ml×1 瓶 2-8℃保存
顯色劑B液 3 ml×1 瓶 6 ml×1 瓶 2-8℃保存
終止液 3ml×1 瓶 6ml×1 瓶 2-8℃保存
濃縮洗滌液 （20ml×20 倍）×1 瓶 （20ml×30 倍）×1 瓶 2-8℃保存

樣本處理及要求：
1.  血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應再次離心。
2.  血漿：應根據(jù)標本的要求選擇 EDTA 或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合 10-20 分鐘后，離心20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應該再次離心。
3.  尿液：用無菌管收集，離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。
4.  細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。檢測細胞內(nèi)的成份時，用 PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。
5.  組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。標本融化后仍然保?2-8℃的溫度。加入一定量的 PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。
6. 標本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融.
7.  不能檢測含 NaN3的樣品，因 NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
操作步驟：
1. 標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設標準品孔 10 孔，在*、第二孔中分別加標準品 100μl，然后在*、第二孔中加標準品稀釋液50μl，混勻；然后從*孔、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉，再各取50μl分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液50ul，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取 50μl 分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液 50μl，混勻后從第七、第八孔中分別取 50μl 加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50μl，濃度分別為90ng/L，60ng/L ，30ng/L，15ng/L，7.5ng/L）。
2. 加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品zui終稀釋度為 5 倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30 分鐘。
4. 配液：將 30（48T的 20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T的 20倍）倍稀釋后備用。
5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后棄去，如此重復 5次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。
7. 溫育：操作同 3。
8. 洗滌：操作同 5。
9. 顯色：每孔先加入顯色劑 A50μl，再加入顯色劑 B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色
15 分鐘.
10. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。
11. 測定：以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止液后 15分鐘以內(nèi)進行。
注意事項：
1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。
2．濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。
3．各步加樣均應使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間控制在5 分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。

4．請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。如標本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD值大于標準品孔*孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n 倍）后再測定，計算時請zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。
5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6．底物請避光保存。
7．嚴格按照說明書的操作進行，試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.
8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。
9．本試劑不同批號組分不得混用。
10.  如與英文說明書有異，以英文說明書為準。
計算：
以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，   
在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD     
值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋    
倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標    
準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值    
代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋    
倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。                 
  （此圖僅供參
試劑盒性能：
1.樣品線性回歸與預期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.95以上。
2.批內(nèi)與批見應分別小于9%和 11%
檢測范圍：                                             
5ng/L -100ng/L                                       
                           
保存條件及有效期：
1.試劑盒保存：；2-8℃。
2．有效期：6個月

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