人白細(xì)胞分化抗原40配體酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用方法
　　
　　檢測范圍：48T
　　
　　30ng/L-2000ng/L
　　
　　使用目的：
　　
　　本試劑盒用于測定人血清、血漿及相關(guān)液體樣本中白細(xì)胞分化抗原40配體（CD40L）含量。
　　
　　實(shí)驗(yàn)原理
　　
　　本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中人白細(xì)胞分化抗原40配體水平。用純化的人抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入40L，再與HRP標(biāo)記的40L抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的40L呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中人白細(xì)胞分化抗原40配體濃度。
　　
　　試劑盒組成
　　
　　120倍濃縮洗滌液20ml×1瓶7終止液3ml×1瓶
　　
　　2酶標(biāo)試劑3ml×1瓶8標(biāo)準(zhǔn)品（2000ng/L）0.5ml×1瓶
　　
　　3酶標(biāo)包被板12孔×4條9標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1.5ml×1瓶
　　
　　4樣品稀釋液3ml×1瓶10說明書1份
　　
　　5顯色劑A液3ml×1瓶11封板膜2張
　　
　　6顯色劑B液3ml×1/瓶12密封袋1個
　　
　　標(biāo)本要求
　　
　　1．標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融
　　
　　2．不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
　　
　　操作步驟
　　
　　標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進(jìn)行稀釋。
　　
　　1000ng/L5號標(biāo)準(zhǔn)品150μl的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
　　
　　500ng/L4號標(biāo)準(zhǔn)品150μl的5號標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
　　
　　250ng/L3號標(biāo)準(zhǔn)品150μl的4號標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
　　
　　125ng/L2號標(biāo)準(zhǔn)品150μl的3號標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
　　
　　62.5ng/L1號標(biāo)準(zhǔn)品150μl的2號標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
　　
　　加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品zui終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
　　
　　溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。
　　
　　配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用
　　
　　洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。
　　
　　加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外。
　　
　　溫育：操作同3。
　　
　　洗滌：操作同5。
　　
　　顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.
　　
　　終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。
　　
　　測定：以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。
　　
　　操作程序總結(jié)：
　　
　　計算
　　
　　以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。
　　
　　注意事項
　　
　　1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。
　　
　　2．濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。
　　
　　3．各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對其準(zhǔn)確性，以避免試驗(yàn)誤差。一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，*使用排槍加樣。
　　
　　請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔*孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測定，計算時請zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。
　　
　　封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
　　
　　6．底物請避光保存。
　　
　　7．嚴(yán)格按照說明書的操作進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).
　　
　　8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。
　　
　　9．本試劑不同批號組分不得混用。
　　
　　10.如與英文說明書有異，以英文說明書為準(zhǔn)。
　　
　　保存條件及有效期
　　
　　1．試劑盒保存：；2-8℃。
　　
　　2．有效期：6個月