zui近由于RNA干擾（RNA interference，RNAi）的發(fā)現(xiàn)使反義領(lǐng)域的研究增多。這種自然發(fā)生的現(xiàn)象zui早是在秀麗線蟲中發(fā)現(xiàn)的（1），是序列特異性地使轉(zhuǎn)錄后的基因沉默的有力機(jī)制。由于zui近兩年在RNAi領(lǐng)域取得的進(jìn)步，已經(jīng)有許多這方面的綜述發(fā)表（2-4）。RNA干擾是由長(zhǎng)的雙鏈RNA分子發(fā)動(dòng)的，該分子可以被Dicer enzyme加工成長(zhǎng)度為21-23個(gè)核苷酸的RNA（見圖）。RNaseIII蛋白被認(rèn)為是作為一個(gè)二聚體發(fā)揮作用，它對(duì)雙鏈RNA的兩個(gè)鏈都進(jìn)行切割，酶切的產(chǎn)物3’末端互相重疊。然后這種小的干擾RNA分子（small interfering RNAs，siRNAs）摻入RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex，RISC），引導(dǎo)核酸酶降解靶RNA。 

這種保守的生化機(jī)制可用于研究多種模式生物的基因功能，但是它在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的應(yīng)用受到阻礙，因?yàn)殚L(zhǎng)的雙鏈RNA分子會(huì)引起干擾素應(yīng)答。因此Tuschi及其同事表明長(zhǎng)度為21nt的siRNA可以特異性的抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因表達(dá)是一個(gè)革命性的突破（5）。這個(gè)發(fā)現(xiàn)激發(fā)了大量利用rnai技術(shù)對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的研究，因?yàn)榕c傳統(tǒng)的反義技術(shù)比，RNAi的性能明顯較高。 反義技術(shù)——RNA干擾（RNA interference，RNAi）
有趣的是，除了短雙鏈RNA，短發(fā)夾RNA（small nuclear RNA，snRNA）比如莖環(huán)結(jié)構(gòu)在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過加工后也可以變成siRNA，從而產(chǎn)生RNA干擾（6、7）。這使得構(gòu)建表達(dá)干擾RNA的載體，從而使哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)沉默成為可能（4、8）。shRNA可以利用RNA聚核酶III啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄，在正常情況下，該啟動(dòng)子是控制小核RNA（small nuclear RNA，snRNA）U6（6、7、9、10）或者RNaseP的組分H1 RNA（11）轉(zhuǎn)錄的。另外一種辦法是兩段短RNA分子分別用U6啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄出來（6、12、13）。載體介導(dǎo)的siRNA表達(dá)使對(duì)功能缺失（loss-of-function）表型進(jìn)行分析成為可能。在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞內(nèi)，兩個(gè)月后仍可觀察到沉默現(xiàn)象（11）。 

另外一種延長(zhǎng)sirna抑制基因表達(dá)時(shí)間的方法是對(duì)化學(xué)合成的RNA進(jìn)行核苷酸修飾。盡管未經(jīng)修飾的短雙鏈RNA在細(xì)胞培養(yǎng)物或者體內(nèi)的穩(wěn)定性出乎意料的高，然而有些情況下，需要對(duì)siRNA的穩(wěn)定性進(jìn)行進(jìn)一步提高。因此，可以在兩條鏈的末端都引入經(jīng)過修飾的核苷（14）。一個(gè)5’端為兩個(gè)2’-O-甲基RNA、3’端為4個(gè)甲基化核苷的siRNA與序列相同但是未經(jīng)修飾的siRNA比活性相同，但是在細(xì)胞培養(yǎng)物中引起的基因沉默現(xiàn)象的時(shí)間延長(zhǎng)。然而，增多siRNA中的甲基化核苷，或者在核苷中引入體積較大的烯丙基將導(dǎo)致siRNA活性下降。 

RNA干擾在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的*個(gè)研究是利用快速注射大量生理溶液的方法將一個(gè)編碼shrna的質(zhì)粒注入老鼠的尾靜脈（15、16）。在大多數(shù)器官中，報(bào)道基因（編碼于共轉(zhuǎn)染質(zhì)?；蛘咿D(zhuǎn)基因小鼠上）的表達(dá)可以被有效地抑制。另外，F(xiàn)as基因被作為肝損傷治療相關(guān)的內(nèi)源靶標(biāo)進(jìn)行了RNA干擾實(shí)驗(yàn)（17）。注射siRNA之后，小鼠肝細(xì)胞中的Fas mRNA和蛋白水平下降了10天。把Fas基因沉默可以保護(hù)小鼠免遭由注射競(jìng)爭(zhēng)性Fas特異抗體引起的爆發(fā)性肝炎，82%用siRNA處理的小鼠活過了10天觀察期，而所有的對(duì)照小鼠在3天之內(nèi)死亡。 
上述研究中采用的高壓導(dǎo)入技術(shù)是一種粗暴的方法，不適于治療用。因此，標(biāo)準(zhǔn)的基因治療所采用的方法被用于RNA干擾。一個(gè)反轉(zhuǎn)錄病毒載體被用于導(dǎo)入siRNA，以抑制人類胰腺腫瘤細(xì)胞中的癌基因K-ras等位基因（18）。負(fù)調(diào)控癌細(xì)胞中K-ras基因的表達(dá)使得它們?cè)谧⑷霟o胸腺的裸鼠皮下之后不再具有形成腫瘤的能力。這項(xiàng)研究還表明siRNA的高度特異性，因?yàn)橹挥邪┗騅-ras被沉默，而與之只有1個(gè)堿基對(duì)差異的野生型等位基因并沒有被沉默。另外，當(dāng)在紋狀區(qū)注射表達(dá)siRNA的腺病毒之后，轉(zhuǎn)基因小鼠大腦中GFP基因的表達(dá)可以被抑制（19）。β－葡萄糖醛酸苷酶（b-glucoronidase）的活性可以通過在小鼠尾靜脈注射重組腺病毒抑制。有趣的是，具有CMV啟動(dòng)子和zui小的polyA尾的RNA聚合酶II表達(dá)元件被用于這個(gè)實(shí)驗(yàn)，為設(shè)計(jì)組織特異性或者可誘導(dǎo)的siRNA載體打開了大門。 

總的來說，siRNA的*個(gè)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)進(jìn)行，其他有重要意義的基因有望于很快作為靶標(biāo)開展研究。至今為止的研究沒有觀察到任何應(yīng)用siRNA引起的毒性作用，但是在治療人類疾病的臨床試驗(yàn)開始之前仍需小心，以排除使用RNA干擾引起的嚴(yán)重副作用。因?yàn)橛胹iRNA使基因表達(dá)沉默與傳統(tǒng)的反義技術(shù)相似，研究者將從十多年來反義技術(shù)研究的教訓(xùn)中獲益，比如需要使用合適的對(duì)照以證明基因表達(dá)的敲除是特異性的，以及對(duì)免疫系統(tǒng)可能引起的意外影響進(jìn)行詳細(xì)分析。 

總結(jié) 
經(jīng)過盛衰沉浮，反義技術(shù)近年來得到越來越多的注意。對(duì)能夠提高靶表親和性和生物穩(wěn)定性、降低毒性的修飾核苷的研究取得了重要進(jìn)展。由于大多數(shù)新的DNA類似物不能激活RNaseH，對(duì)反義寡核苷酸的設(shè)計(jì)需要考慮靶mRNA是否需要保留，例如，是改變剪接方式，還是降解靶mRNA（這種情況下應(yīng)該使用gapmer技術(shù)）?？梢酝ㄟ^有系統(tǒng)的修飾天然核酶或者通過體外選擇技術(shù)獲得具有高催化活性的穩(wěn)定核酶。一些反義寡核苷酸和核酶已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)研究，一個(gè)反義藥物已經(jīng)在1998年獲得批準(zhǔn)。一個(gè)重要的突破是發(fā)現(xiàn)短的雙鏈RNA分子可用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中特異性沉默基因表達(dá)。這個(gè)方法與傳統(tǒng)的反義技術(shù)比效率明顯更高，并且一些體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)已經(jīng)發(fā)表。因此，反義技術(shù)有望廣泛應(yīng)用于對(duì)未知功能基因的研究、藥物靶標(biāo)的確認(rèn)和治療。