Q1．無CT值（信號(hào)）出現(xiàn)
A1．1.反應(yīng)循環(huán)數(shù)不夠。一般都要在35個(gè)循環(huán)以上，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況增加循環(huán)（如至45cycles），但高于45個(gè)循環(huán)會(huì)增加過多的背景信號(hào)。
2.檢測(cè)熒光信號(hào)的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時(shí)采集，taqman法則一般在退火結(jié)束時(shí)或延伸結(jié)束采集信號(hào)。
3.引物或探針降解?？赏ㄟ^PAGE電泳檢測(cè)其完整性。
4.引物或探針的設(shè)計(jì)，如探針高于引物的溫度不夠，造成探針未雜交上而產(chǎn)物已延伸的情況。
5.模板量不足。對(duì)未知濃度的樣品應(yīng)從系列稀釋樣本的zui高濃度做起。
6.模板降解。避免樣品制備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況。
Q2．CT值出現(xiàn)過晚
A2.1.擴(kuò)增效率低，反應(yīng)條件不夠優(yōu)化。設(shè)計(jì)更好的引物或探針；改用三步法進(jìn)行反應(yīng)；適當(dāng)降低退火溫度；增加鎂離子濃度等。
2.PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足。
3.PCR產(chǎn)物太長(zhǎng)。一般采用80-150bp的產(chǎn)物長(zhǎng)度。
Q3．標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系不佳
A3.1.加樣存在誤差，使得標(biāo)準(zhǔn)品不呈梯度。
2.標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)降解。應(yīng)避免標(biāo)準(zhǔn)品反復(fù)凍融，或重新制備并稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。
3.引物或探針不佳。重新設(shè)計(jì)更好的引物和探針
4．模板中存在抑制物，或模板濃度過高
Q4．陰性對(duì)照也出現(xiàn)明顯的起飛
A4．1.應(yīng)mix或水被污染。
2.引物二聚體的出現(xiàn)。用SG法在35cycles以后陰性出現(xiàn)起飛屬正常情況，可配合熔解曲線進(jìn)行分析。
3.反應(yīng)過程中探針的降解。用PAGE電泳對(duì)探針進(jìn)行檢測(cè)。
4.如果使用了ROX校正，則可能是ROX的降解所造成。
Q5．在溶解曲線前是否插入一個(gè)同溶解程序初始溫度相同的一個(gè)保溫過程
A5．如果在熔解曲線前沒有一個(gè)保溫過程，則曲線會(huì)在前幾個(gè)循環(huán)非常陡峭，使真正的熔解峰型幾乎看不到。
Q6．熔解曲線不止一個(gè)主峰
A6．1．引物設(shè)計(jì)不夠優(yōu)化。應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。
2.引物濃度不佳。適當(dāng)降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比。
3.鎂離子濃度過高。適當(dāng)降低鎂離子濃度，或選擇更合適的mix試劑盒。
4.模板有基因組的污染。RNA提取過程中避免基因組DNA的引入，或通過引物設(shè)計(jì)避免非特異擴(kuò)增。
Q7．?dāng)U增效率低
A7．1.反應(yīng)試劑中部分成分特別是熒光染料降解。
2.反應(yīng)條件不夠優(yōu)化，可適當(dāng)降低退火溫度或改為三步擴(kuò)增法。
3.反應(yīng)體系中有PCR反應(yīng)抑制物。一般是加入模板時(shí)所引入，應(yīng)先把模板適度稀釋，再加入反應(yīng)體系中，減少抑制物的影響。
Q8．實(shí)驗(yàn)重復(fù)性不好
A8．1.加樣不準(zhǔn)確。
2.儀器在樣品上溫度條件有差異，即溫度均一性不好。
3.模板濃度低。樣品初始濃度越低，重復(fù)性越差，應(yīng)減少樣品的稀釋倍數(shù)。
Q9．變性溫度是否合適
A9．大部分的雙鏈DNA在95°C就開始解鏈了，在有些情況下在90至94°C都不能很好地變性DNA。由于部分變性，參加反應(yīng)的探針和引物相應(yīng)的減少了，因此反應(yīng)效率會(huì)下降。
Q10．變性時(shí)間是否合適
A10．15到20秒對(duì)于變性擴(kuò)增子是足夠了，然而，長(zhǎng)一點(diǎn)的產(chǎn)物，可能會(huì)需要30秒，60秒的變性時(shí)間通常是不需要的。
Q11．退火溫度和時(shí)間是否合適
A11．檢查引物和探針的Tm值，SYBRGreenI的退火時(shí)間大約20到35秒，雙標(biāo)記探針通常是兩步法，退火和延伸合并為一步，時(shí)間大約是45到60秒，溫度通常在60°C，對(duì)于FRET探針退火步驟大約20到30秒。
Q12．在哪一步驟采集信號(hào)
A12．SYBRGreenI應(yīng)當(dāng)在72°C，此時(shí)絕大部分的DNA是雙鏈狀態(tài)，如上所述，雙標(biāo)記探針通常是兩步檢測(cè)，因此信號(hào)采集應(yīng)該在退火延伸的整合步驟。對(duì)于FRET檢測(cè)，數(shù)據(jù)應(yīng)該在退火步驟檢測(cè)。如果對(duì)于信號(hào)采集點(diǎn)不確定，可以多點(diǎn)采集作對(duì)比。如果監(jiān)控屏幕檢測(cè)不到信號(hào)，檢查程序設(shè)定是否存在至少一個(gè)的信號(hào)采集點(diǎn)。
Q13．是否選定了合適的增益值
A13．一些情況下會(huì)看到曲線超過了窗口范圍，在熒光強(qiáng)度100的地方成一直線。盡管大部分的數(shù)據(jù)可以用，但是減少增益，一些原始數(shù)據(jù)就不會(huì)超出范圍。有時(shí)，在*個(gè)循環(huán)信號(hào)就跳出了窗口范圍，這是由于增益選得太高，看起來像沒有檢測(cè)到數(shù)據(jù)。如果熔解曲線分析時(shí)，開始熒光就達(dá)到了100，則應(yīng)當(dāng)用低的增益重新運(yùn)行，而不需要重新運(yùn)行擴(kuò)增反應(yīng)，SYBRGreenI和FRET的樣品可以在一定程度上反復(fù)使用
