ELISA直接法測長葉車前花葉病毒（RMV）含量實(shí)驗(yàn)步驟

1.       將不同濃度的待檢測RMV溶液作為樣品液，在測定板每孔各加250ul,至冰箱（4℃）中孵育過夜。

2.       孵育后，去除孔穴內(nèi)抗原溶液，用PBS-Tween20溶液緩緩沖洗孔穴3次，每次3min，然后去凈洗滌液。

3.       每孔穴加250ulRMV的酶標(biāo)記抗體溶液（用1%牛血清白蛋白的PBS- ween20稀釋）在恒溫箱（37℃）里孵育3-6h,或6℃下過夜。

4.       去除孔穴酶標(biāo)記抗體溶液，用PBS-Tween20溶液緩緩沖洗3次每次3min，然后去凈洗滌液。

5.       每孔穴加入新鮮配備的底物溶液250ul,室溫放置0.5h，或者放置出現(xiàn)黃色。

6.       加入50ul3N NaOH，終止反應(yīng)。

7.       對每孔穴的黃色溶液，測定449nm波長處的吸光值。

討論

1.       如該聚苯乙烯塑料微量反應(yīng)板*次使用，應(yīng)分別用標(biāo)準(zhǔn)濃度的RMV溶液、RMV的抗血清及RMV與它的IgG形成的免疫結(jié)合物，進(jìn)行期盼滴定法來測該聚苯乙烯塑料微量反應(yīng)板對RMV抗原和它的抗體的吸附能力。

2.       在正式測樣品前，用0.1mol/L pH9.6碳酸鹽緩沖液配置各種標(biāo)準(zhǔn)濃度的RMV溶液，依照實(shí)驗(yàn)步驟測定RMV各種標(biāo)準(zhǔn)濃度的A449nm值，以病毒標(biāo)準(zhǔn)濃度為橫坐標(biāo)，A449nm值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，由此可以測出RMV包被的濃度。

3.       測出原始底物的吸光值，以便核準(zhǔn)數(shù)據(jù)。

4.       對照標(biāo)準(zhǔn)曲線，就可算出樣品液中RMV的含量。

5.       如無牛血清白蛋白，可用0.1%白明膠代替。

6.       對于不穩(wěn)定的病毒，用中性緩沖液稀釋。

7.       如有ELISA測定儀，可快速測定。

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