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基因合成實驗

時間:2016-2-19閱讀:139
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獲得一段特需列的zui直接的方法就是化學合成。本方案是利用成對的寡核苷酸,通過其3’端的退火而生成一短的雙鏈區(qū),寡核苷酸既作為模板,又起引物的作用,長達 400 bp 的所需片段通過一步反應即可合成。

實驗材料

DNA

試劑、試劑盒

dNTPDAN聚合酶乙醇TE限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液

儀器、耗材

水浴鍋培養(yǎng)箱

實驗步驟

1.  將兩種寡核苷酸各1 μg加入微量離心管中,加水至17 μl,再加2 μl 的10×測序酶緩沖液。70℃加熱5 min,然后在合適的退火溫度下保溫5  min,取2 μl 留待以后的分析。

 

2.  加2 μl 4種dNTP混合液和10 U測序酶,30℃溫育30 min。

 

3.  70℃ 10 min 滅活DNA聚合酶,取2 μl 留待以后的分析。

 

4.  加10×限制性內(nèi)切酶反應緩沖液,加水和20~100 U 的適合于克隆的限制性內(nèi)切酶至100 μl。適當?shù)臏囟认孪? h 以上。

 

5.  酚抽提,加100 μl 4 mol/l 乙酸銨和400 μl 的無水乙醇,-70℃沉淀15 min,離心5 min,沉淀重懸于100 μl TE緩沖液,用乙醇再沉淀一次,用95%乙醇洗滌沉淀,干燥,20 μl TE緩沖液溶解,取2 μl 用于以后的分析。

 

6.  用篩分型瓊脂糖凝膠電泳分析確證原材料、延伸產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物,估計延伸的寡核苷酸的量,再用適當?shù)妮d體亞克隆。

 

7.  對幾個合適的亞克隆測序。

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