枯草芽孢桿菌168

SPI 培養(yǎng)基EGTASPII 培養(yǎng)基檸檬酸鈉EGTA氫氧化鈉KH2PO4K2HPO4MgCl2MgSO4葡萄糖酵母膏( NH4 )2SO4

培養(yǎng)箱培養(yǎng)皿錐形瓶紫外分光光度計(jì)接種環(huán)離心管

1.  SP 鹽

0.2%( NH₄ )₂SO₄，1.4% K₂HPO₄，0.6% KH₂PO₄， 0.02% MgSO₄·7H₂O， 0.1% 檸檬酸鈉。

2.  CAYE (100×)

2 % Casamino acid，10%酵母膏。

3.  SPI 培養(yǎng)基

SP 鹽溶液加入1 %體積濃度為50%葡萄糖溶液，1 %體積100×CAYE 溶液。

4.  SPII 培養(yǎng)基

SPI 培養(yǎng)基加入1 %體積50 mmol/L CaCl₂ 溶液，1 %體積250 mmol/L MgCl₂ 溶液。

5.  SP-A Salts Solution(500 ml) 

（1）0.4% (NH₄)₂SO₄ ：2 g

（2）2.8% K₂HPO₄·3H₂O ：14 g

（3）1.2% KH₂PO₄ ：6 g

（4）0.2% Trisodium Citrate Dihydrate ：1g

（5）121°C滅菌20 min。

6.  SP-B Salts Solution(500 ml)

（1）0.04% MgSO₄·7H2O： 0.2 g

（2）121°C滅菌20 min。

7.  100×CAYE Solution(100 ml)

（1）2% Casamino acid ：2 g

（2）10% Yeast Extract：10 g 

（3）121°C滅菌20 min。

8.  SPI Medium(20 mL)

 SP-A Salts Solution：9.8 mL

 SP-B Salts Solution：9.8 mL

 (1%V)Glucose(50%w/v，115°C滅菌20 min) ：200 μL

 (1%V)100×CAYE：200 μL

10.  SPII Medium(6 mL)

SPI Medium：5.88mL

(1%V)50mM CaCl₂ ：60μL

(1%V)250mM MgCl₂：60μL

11.  100×EGTA Solution

10mmol/L EGTA 溶液，溶解時(shí)需加少量NaOH 至pH8.0。

二、實(shí)驗(yàn)步驟

2.  轉(zhuǎn)化前一天晚間挑單菌落至3 ml LB 培養(yǎng)基中，37°C，250 r/min 培養(yǎng)過(guò)夜。

3.  第二天上午取160 μl 培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至8 ml SPI 培養(yǎng)基中，37°C，250 r/min 培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期(168 約4-5 h)。

4.  取0.2 ml 生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期末的培養(yǎng)液至2 ml SPII 培養(yǎng)基中，37 °C，100 r/min 培養(yǎng)90 分鐘。

5.  在上述SPII培養(yǎng)基的菌體中加入20 μl 10mmol/L EGTA，再于37°C，100 r/min 培養(yǎng)10 分鐘。

6.  將上述處理后的菌液分裝成0.5 ml 每管，各加入5 μl DNA(DNA 量不能過(guò)高，不超過(guò)5 μg)，再于37 °C，250 r/min 培養(yǎng)90 分鐘，取菌液涂布篩選平板。

2. 8ml SPI 培養(yǎng)基要放于50 ml 離心管中培養(yǎng)，以保證菌體的生長(zhǎng)狀態(tài)，不要使用玻璃試管。

3. 注意測(cè)定OD值，一定要等菌體生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期后期。

4. 保證菌體的濃度，可以提高轉(zhuǎn)化率。