哺乳動(dòng)物

PBS低滲緩沖液低鹽緩沖液透析緩沖液

轉(zhuǎn)子離心機(jī)電導(dǎo)計(jì)透析膜勻漿機(jī)離心管

1a.  收集轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的細(xì)胞：將濃度為5~10×10⁸細(xì)胞/l 的培養(yǎng)液用1 L 的塑料瓶1 850 g 離心20 min，將細(xì)胞收入50 ml 錐形離心管中（每管收2~3 L 培養(yǎng)液中的細(xì)胞）。進(jìn)行步驟2。

1b.  收集單層培養(yǎng)的細(xì)胞：?jiǎn)螌蛹?xì)胞長(zhǎng)滿后去掉培養(yǎng)液。用PBS洗1次。將細(xì)胞刮入新鮮PBS液里，倒進(jìn)錐形離心管中。進(jìn)行步驟2。

2.  1 850 g 離心10 min。

3a.  轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)細(xì)胞：測(cè)量壓緊后細(xì)胞的體積。將細(xì)胞重懸于約5倍于其pcv的PBS液中，1 850 g 離心10 min。進(jìn)行步驟4。

3b.  單層培養(yǎng)細(xì)胞：測(cè)量pcv，進(jìn)行步驟4。

4.  快速地將沉淀的細(xì)胞重懸于5倍體積的低滲緩沖液中，1 850 g 離心10 min。將細(xì)胞沉淀重懸于3倍于原pcv的低滲緩沖液中，放置在冰上10 min，讓細(xì)胞腫脹。

5.  在Dounce氏玻璃勻漿器中用B號(hào)研杵緩饅上下抽提10次以上。用臺(tái)盼藍(lán)染色排斥法在顯微鏡下檢査細(xì)胞裂解滑況（應(yīng)大于80%~90%）。

6.  3 300 g 離心15 min，保留上清用來制備S-100細(xì)胞質(zhì)提取物。

7.  測(cè)量第6步離心沉淀的壓緊后的細(xì)胞核體積。用1/2 pnv體積的低鹽緩沖液重懸細(xì)胞核（必要時(shí)用Dounce氏玻璃勻漿器勻漿一次）。

8.  在輕輕攪拌的同時(shí)，逐滴加入1/2 pnv體積的高鹽緩沖液。終濃度應(yīng)約為300 mmol/l。

9.  25 000 g 離心30 min，測(cè)量核提取物的電導(dǎo)率（用上請(qǐng)，見步驟10）。

10.  將核提取物加入透析管中，在50倍體積的透析液中進(jìn)行透析，直到提取物的電導(dǎo)率和透析液一致為止（當(dāng)提取物的KCl濃度達(dá)到100 mmol/l 時(shí)）。盡量縮短透析時(shí)間。

11.  將提取物從透析袋中移出45 000 g 離心20 min。

12.  用Bradford分析法測(cè)定上清中蛋白質(zhì)的濃度。分裝，浸入液氮中速凍，- 80℃保存。