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細(xì)菌中制備基因組DNA實(shí)驗(yàn)

時(shí)間:2016-4-12閱讀:159
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真核生物的一切有核細(xì)胞(包括培養(yǎng)細(xì)胞)都能用來(lái)制備基因組 DNA。真核生物的DNA是以染色體的形式存在于細(xì)胞核內(nèi),因此,制備DNA的原則是既要將DNA與蛋白質(zhì)、脂類和糖類等分離,又要保持DNA分子的完整。

實(shí)驗(yàn)方法原理提取DNA的一般過(guò)程是將分散好的組織細(xì)胞在含SDS(十二烷基硫酸鈉)和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白質(zhì),再用酚和氯仿/異戊醇抽提分離蛋白質(zhì),得到的DNA溶液經(jīng)乙醇沉淀使DNA從溶液中析出。
實(shí)驗(yàn)材料

細(xì)菌

試劑、試劑盒

TE氯化銫溴化乙錠NaCl乙醇CTAB

儀器、耗材

離心機(jī)搖床

實(shí)驗(yàn)步驟

1.  培養(yǎng)5 ml 的細(xì)菌培養(yǎng)物至飽和狀態(tài),取1.5 ml 的培養(yǎng)物離心2 min。

2.  沉淀物加入567 μl 的TE緩沖液,用吸管反復(fù)吹打使之重懸。

3.  加入30 μl10%的SDS和3 ℃ 20 mg/ml蛋白酶K,混勻,于37℃溫育1 h。

 

4.  加入100 μl 5 mol/l NaCl充分混勻,再加入80 μlCTAB/NaCl溶液,混勻,于65℃溫育10 min。

 

5.  加入等體積的氯仿/異戊醇,混勻,離心4~5 min將上清液轉(zhuǎn)人一個(gè)新管中,如果難以移出上清,先用牙簽除去界面物質(zhì)。

 

6.  加入等體積的酚/氯仿/異戊醇,混勻,離心5 min,將上清液轉(zhuǎn)入一只新管中。

 

7.  加入0.6體積異丙醇,輕輕混合直到DNA沉淀下來(lái),用一個(gè)封口的巴斯德管將沉淀轉(zhuǎn)移至1 ml 的70%乙醇中洗滌。

 

8.  離心5 min,棄上清,用凍干機(jī)稍加干燥,重溶于的下100 μl TE緩沖液,每次酶切反應(yīng)用10~15 μl。

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