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上海銳谷生物科技有限公司作者
一個PCR反應(yīng)開始，首先是雙鏈DNA解離為單鏈，使之有利于與引物結(jié)合過程可以通過加熱來完成。在90—95℃條件下，即使復(fù)雜的DNA分子，如人基因組DNA也可變性成單鏈，根據(jù)模板DNA復(fù)雜程度，可以調(diào)整變性溫度和時間。一般情況下選擇94‘C、30s可使各種復(fù)雜DNA分子*變性。過高溫度或持續(xù)時間過長，對TaqDNA聚合酶活性和dNTP分子都會造成損害。
變性后的DNA很快冷卻至40～60℃，即可使引物和模板DNA發(fā)生結(jié)合。這是由于模板DNA結(jié)構(gòu)比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間碰撞的機(jī)會大大高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞。復(fù)性溫度的選擇，可以根據(jù)引物的長度和其G-+-C含量確定。引物長度為15～25bp時，退火溫度可通過Tm＝4X（G+C）+2X（Ad-T）計算得到。在Tm允許的溫度范圍內(nèi)，選擇較高的退火溫度可大大減少引物和模板之間的非特異結(jié)合，提高
PCR的特異性。退火時間設(shè)置為30s，足以使引物和模板之間*結(jié)合。
PCR反應(yīng)的延伸溫度為70—75℃，此時，TaqDNA聚合酶具有zui高活性。引物在16個核苷酸以下時，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。可采用反應(yīng)溫度緩慢升高到70～75℃的方法。因?yàn)樵趜ui初較低溫度下，DNA聚合酶已催化延伸反應(yīng)開始，隨后的較高溫度不會對“延長”過的引物和DNA模板的結(jié)合發(fā)生影響。PCR延伸反應(yīng)的時間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長度而定。一般lkb以內(nèi)的片段，延伸時間lmin足夠。擴(kuò)增片段在lkb以上則需增加延伸時間。
以上參數(shù)確定后，PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。理論上20～25次循環(huán)后，PCR產(chǎn)物的積累即可達(dá)到zui大值。實(shí)際操作中由于每步反應(yīng)的產(chǎn)率不可能達(dá)到*，因此不管模板濃度多少，20～30次是比較合理的循環(huán)次數(shù)。循環(huán)反應(yīng)的次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量也會增加。
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